病毒重组与突变技术实例

第一编 DNA病毒重组技术研究实例 3

第1章 绪论 3

1.1 伪狂犬病病毒的分子生物学研究进展 4

1.2 重组伪狂犬病病毒活载体研究进展 9

1.3 重组伪狂犬病毒的筛选 13

1.4 重组伪狂犬病毒的评价 14

1.5 猪传染性胃肠炎病毒S基因分子生物学研究进展 15

1.6 猪传染性胃肠炎病毒发病机理与免疫机制 19

1.7 猪传染性胃肠炎的防治 20

1.8 猪传染性胃肠炎病毒疫苗研究现状 21

1.9 重组活载体疫苗及其研发原则 23

第2章 转移载体pUGS-LacZ的构建 27

2.1 含PrV PK（部分）和gG基因的重组质粒pUG的构建 27

2.2 含TGEV Sa基因和SV40 PolyA序列的重组质粒pHSV的构建 33

2.3 表达TGEV S基因主要抗原位点的PrV转移载体构建 38

2.4 小结 41

第3章 重组伪狂犬病病毒的获得 46

3.1 转移载体pUGS-LacZ质粒的提取 46

3.2 PrV/Bartha K-61基因组的提取 47

3.3 转移载体与Bartha K-61基因组的共转染 48

3.4 小结 49

第4章 重组病毒rPrV-TGEV-S1的筛选、纯化和鉴定 51

4.1 重组病毒rPrV-TGEV-S1的筛选和纯化 51

4.2 重组病毒rPrV-TGEV-S1的PCR鉴定 51

4.3 小结 55

第5章 重组病毒rPrV-TGEV-S1中S1片段的表达检测 57

5.1 Western boltting检测 57

5.2 间接免疫荧光检测 58

5.3 小结 59

第6章 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在毒种特性上的比较 61

6.1 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在不同细胞上的毒价和病变形态的比较 61

6.2 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在穿人能力上的比较 63

6.3 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株一步生长曲线的比较 63

6.4 重组病毒rPrV-TGEV-S1与亲本毒株在理化性质上的比较 64

6.5 小结 65

第7章 重组病毒rPrV-TGEV-S1接种BALB/C小鼠实验 68

7.1 实验动物分组 68

7.2 腹腔免疫实验 68

7.3 鼻腔免疫实验 68

7.4 免疫小鼠血清抗体检测 69

7.5 免疫小鼠鼻腔灌洗物与肠黏液的抗体检测 71

7.6 免疫小鼠乳汁中的抗体检测 72

7.7 免疫小鼠血清的中和抗体实验 73

7.8 小结 75

第二编 RNA病毒突变技术研究实例 81

第8章 绪论 81

8.1 EIAV认知历史和现状 84

8.2 EIAV的生物学特性 85

8.3 EIAV的分子生物学 87

8.4 EIAV基因非编码区LTR相关研究进展 95

8.5 EIAV主要基因的变异研究进展 101

8.6 EIAV的免疫学研究进展 105

8.7 中国EIA弱毒疫苗及相关研究进展 111

8.8 慢病毒与糖基化 116

8.9 本研究的目的和意义 121

第9章 强弱毒包含完整S2和gp90及部分gp45基因的扩增 122

9.1 驴白细胞的培养 122

9.2 EIAV病毒RNA的提取及基因扩增 122

9.3 小结 135

第10章 EIAVFDDV N-连接糖基化回复突变感染性克隆的构建 139

10.1 pMD18-Tg5,pMD18-Tg9,pMD18-Tg10,pMD18-Tg5g9,pMD18-Tg5g10,pMD18-Tg9g10,pMD18-Tg5g9g10突变克隆的构建 139

10.2 pLGFDg5,pLGFDg9,pLGFDg10,pLGFDg5g9,pLGFDg5g10,pLGFDg9g10,pLGFDg5g9g10突变克隆的构建 144

10.3 小结 147

第11章 转染及感染性 150

11.1 质粒的提取和纯化 150

11.2 质粒在细胞培养中的转染和传代 152

11.3 转染传代后细胞培养物中EIAV的检查 156

11.4 嵌合病毒复制动力学分析 163

11.5 病毒与抗血清的中和实验 167

11.6 小结 169

附录 172

附录A 转移载体pUG-LacZ构建流程图 172

附录B 转移载体pUG-LacZ与亲本病毒Bartha K-61同源重组后外源基因插入示意图 173

附录C 实验材料 174

附录D 马克隆EIAV强毒（EIAVL）env基因gp90的核苷酸序列 177

附录E 实验材料 197

参考文献 200