高级生物化学实验

第一章 缓冲溶液的作用原理及配制 1

第一节 缓冲溶液的作用原理 1

一、缓冲溶液的作用原理 1

二、缓冲容量与缓冲范围 2

第二节 缓冲溶液的配制 2

一、影响缓冲溶液pH的因素及缓冲溶液的选择与配制 2

二、缓冲溶液的应用原则 3

三、不同缓冲溶液的优缺点 3

第二章 生物材料的预处理 7

第一节 生物样品的保存 7

一、新鲜固态样品的保存 7

二、液态样品的保存 7

第二节 生物材料预处理技术 8

一、细胞的破碎 8

二、提取与纯化 10

第三章 实验误差控制 15

第一节 实验误差 15

一、实验误差 15

二、精密度和偏差 15

三、实验误差的来源 16

第二节 提高准确度的方法 17

一、减少系统误差的方法 17

二、减少偶然误差的方法 18

三、正确取舍有效数字 18

第四章 蛋白质研究技术与方法 20

第一节 蛋白质分离纯化的一般方法 20

一、以蛋白质溶解度为基础的分离方法 20

二、以蛋白质电荷性质为基础的分离方法 20

三、以蛋白质分子大小为基础的分离方法 24

四、以蛋白质生物活性为基础的分离方法 25

第二节 蛋白质分离纯化的新技术与新方法 25

一、蛋白质二维荧光差异凝胶电泳技术 25

二、毛细管电泳 27

三、反相液相色谱法 28

四、反胶团萃取法 28

五、蛋白质分离方法的选择、组合和优化 29

实验一 蛋白质含量测定法 29

Ⅰ．微量凯氏定氮法（Kjeldahl法） 30

Ⅱ．双缩脲法（Biuret法） 33

Ⅲ．Folin－酚试剂法（Lowry法） 34

Ⅳ．考马斯亮蓝法（Bradford法） 36

Ⅴ．紫外吸收法 39

Ⅵ．二喹啉甲酸法（BCA法） 42

实验二 小麦钙调蛋白的分离、纯化 44

实验三 小麦钙调蛋白的抗体制备及检测 46

实验四 植物组织蛋白质二维电泳分离分析 49

第五章 酶学研究技术与方法 59

第一节 酶活力测定及酶的纯度与回收率 59

一、酶活力测定 59

二、纯化方法与条件的比较标准 60

三、纯度标准 60

第二节 酶活力测定的常用技术和方法 61

一、量气法 61

二、比色法与分光光度法 61

实验五 苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定 62

Ⅰ．PAL的提取及测定——离心和盐析的应用 63

Ⅱ．PAL的纯化——分子筛和离子交换层析的应用 65

实验六 Eadie-Hofstee法测定辣根过氧化物酶的Km和Vmax 67

实验七 酶偶联分析法测定植物己糖激酶的活力 70

实验八 两相分配法制备大豆子叶质膜及其纯度鉴定 73

实验九 金属螯合亲和层析分离纯化玉米SOD 79

实验十 大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提取以及生物化学性质表征 82

第六章 核酸研究技术和方法 90

第一节 核酸研究的基本要求 90

一、材料与方法的选择 90

二、选择的原则 90

三、核酸完整性的保持 90

第二节 技术路线的设计 91

一、核酸的释放 91

二、核酸的分离与纯化 91

三、核酸质量与提取步骤的关系 91

四、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 91

实验十一 植物基因组DNA的提取及含量、纯度检测 92

Ⅰ．植物基因组DNA的提取（CTAB法） 92

Ⅱ．植物DNA纯度的鉴定——紫外分光光度计法 94

Ⅲ．植物DNA相对分子质量的测定——琼脂糖凝胶电泳法 94

实验十二 一步法共提取昆虫中肠DNA、RNA及蛋白质 96

实验十三 小RNA的分离纯化 99

Ⅰ．小RNA分离、纯化及修饰 99

Ⅱ．修饰后小RNA的克隆转化及测序 104

Ⅲ．测序结果的生物信息学分析 106

实验十四 油菜cDNA文库的构建 107

Ⅰ．植物组织总RNA的提取及电泳分析 107

Ⅱ．cDNA文库的构建 109

实验十五 Southern印迹 112

第七章 糖类研究技术和方法 118

第一节 糖生物化学研究总论 118

第二节 糖的提取及纯化 119

第三节 多糖的组成分析 119

第四节 多糖的结构分析 121

实验十六 还原糖和总糖的测定 123

实验十七 非还原糖的高效液相色谱分析 125

实验十八 可溶性糖的硅胶G薄层层析 128

实验十九 黏多糖——肝素效价的测定 130

实验二十 水溶性苦瓜多糖的制备及分离纯化 132

实验二十一 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定山楂多糖 135

实验二十二 多糖结构分析 137

Ⅰ．糖含量测定 138

Ⅱ．单糖组成分析 139

Ⅲ．糖链的序列测定 140

第八章 植物次生代谢物概述 144

第一节 次生代谢物的概念与特性 144

一、次生代谢物的概念 144

二、次生代谢物的特性 144

第二节 次生代谢物的研究方法 144

一、同位素示踪法 145

二、细胞培养法 145

三、荧光标记法 146

四、单细胞凝胶电泳法 146

实验二十三 红豆杉紫杉醇生物碱的分离与鉴定 147

实验二十四 植物倍半萜的分离与酸化度分析 149

实验二十五 黄连中黄连素的提取及其紫外光谱分析 151

Ⅰ．黄连中黄连素的提取 151

Ⅱ．黄连素的紫外光谱分析 152

实验二十六 虎杖蒽醌类成分的提取分离及结构鉴定 154

实验二十七 植物材料中总黄酮分离提取及鉴定 156

实验二十八 从茶叶中提取咖啡因 157

附录 162

附录一 离心技术 162

附录二 常用蛋白质Mr标准参照物 166

附录三 常用缓冲溶液的配制方法 166

附录四 实验室中常用酸碱的相对密度和浓度 172

附录五 硫酸铵饱和度的常用表 173

附录六 常用相关网站 174

主要参考文献 176