激光扫描共聚焦显微镜技术教程

目录 1

第一部分　激光扫描共聚焦显微镜的基本知识 1

序言 3

第一章　激光扫描共聚焦显微镜的基本结构、工作原理及基本功能 4

一、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构和工作原理 4

（一）激光光源 5

（二）扫描器 9

（三）激光扫描共聚焦显微镜使用的荧光显微镜的特点和要求 9

（四）计算机系统 11

二、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能 12

（一）采集和处理图像 12

（二）荧光分子的定性及定位 13

（三）定量测定 14

（四）激光扫描共聚焦显微镜可获取的图像的种类 15

（五）光谱交叉干扰及其消除 18

一、光的本质 21

第一节　荧光光谱基础知识 21

第二章　荧光探针的选择和荧光样品的制备 21

二、荧光的产生 22

三、荧光的淬灭 23

四、激发光谱和发射光谱 24

第二节　用于共焦显微镜测定的荧光样品的制备 26

一、组织和细胞样品中荧光的来源 26

二、荧光样品的制备要求 27

（二）确定可供选择的荧光探针的范围 28

（一）根据实验目的确定需要检测的指标 28

三、选择荧光探针的主要步骤和方法 28

（三）考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求 29

（四）考察荧光探针与所用的共聚焦显微镜系统的匹配情况 30

（五）检查实验中存在的干扰情况 31

四、用荧光探针标记样品的过程及注意事项 31

（一）荧光标记前样品的预处理 31

（二）用荧光探针标记样品 32

（一）用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 37

一、原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 37

第三章　激光扫描共聚焦显微镜在医学及生物学研究中的应用 37

（二）用激光扫描共聚焦显微镜原位检测蛋白质、抗体及其他分子 40

（三）检测细胞凋亡 44

（四）细胞器的观察及测定 47

（五）检测细胞融合 48

（六）观察细胞骨架 48

（七）检测细胞间缝隙连接通讯 48

（一）实时定量测定细胞内Ca2+的变化 49

二、活体细胞或组织功能的实时动态监测 49

（八）检测细胞内脂肪 49

（二）测定细胞内pH变化 50

（三）检测膜电位的变化 51

（四）检测细胞内活性氧物种的产生 52

（五）检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位 53

（六）检测荧光共振能量转移 53

（七）检测荧光漂白恢复 54

第二部分　激光扫描共聚焦显微镜技术教学实验 55

实验一　激光扫描共聚焦显微镜系统的结构、开关机操作及注意事项 57

实验二　细胞内核酸的标记及其共焦图像采集方法 60

实验三　微分干涉差显微方法获取细胞光镜图像 64

实验四　荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞肌动蛋白微丝 66

实验五　动物细胞微管-微丝-细胞核的同时定位观察 70

实验六　激光扫描共聚焦显微术测定单细胞凝胶电泳胶板中的“彗星” 72

实验七　用激光扫描共聚焦显微镜原位检测细胞凋亡 75

实验八　原位实时定量测定细胞内Ca2+浓度的动态变化 80

实验九　荧光探针标记法检测活细胞中活性氧物种的变化 84

实验十　活体脑片细胞内Ca2+及活性氧物种的测定 87

实验十一　用共聚焦显微镜和图像分析仪测定细胞膜电位的变化 91

实验十二　细胞内脂肪的检测 94

实验十三　细胞间缝隙连接通讯的检测——划痕标记染料示踪技术 96

实验十四　利用荧光光谱曲线分离并共定位细胞内的多种荧光蛋白 99

附录1　激光扫描共聚焦显微镜需准备的器皿及要求 101

附录2　多（双）光子激光扫描显微镜系统（简介） 103

附录3　荧光相关光谱—激光扫描共聚焦显微镜技术（简介） 107

主要参考文献 109